Различные 5'-нетранслируемые последовательность (5'-НТП), способные служить усилителем (энхансером) экспрессии целевого белка.

Идентификация природных последовательностей (либо синтез искусственных), которые будут усиливать биосинтез белка на уровне инициации трансляции как в прокариотических (бактерии), так и в эукариотических организмах (растения) на сравнимом уровне.

В работе применены методы центрифугирования, электрофореза нуклеиновых кислот, флюорометрической детекции белка, ПЦР-анализ, методы выделения нуклеиновых кислот и общего белка из бактериальных клеток, а также стандартные методики клонирования генно-инженерных кассет.

В ходе исследований был проведен компьютерный анализ ряда последовательностей потенциально или доказано обладающих усиливающим эффектом на трансляцию белка in vitro или in vivo в бактериальных либо растительных клетках. Эти последовательности были либо синтезированы в виде адаптеров в коммерческих фирмах, либо получены с помощью ПЦР на имеющихся матрицах. Далее они были клонированы на место 5’-НТП гена β-глюкуронидазы (GUS) в экспрессионном векторе pET23c (“Invitrogen”), что дало 29 экспрессионных плазмид идентичных во всем, кроме 5’-НТП. С полученных конструкций была проведена индуцированная экспрессия GUS в клетках E. coli при стандартных температурных условиях культивирования клеток в 37°С. В препаратах тотального растворимого белка бактериальных клеток оценивали активность GUS.

По имеющимся данным нами было получено несколько энхансеров, сравнимых (статистически значимо) по степени усиления биосинтеза белка in vivo с канонической последовательностью Шайн-Далгарно.

Генетическая инженерия, биотехнология растений и микроорганизмов.

Различные 5'-нетранслируемые последовательность (5'-НТП), способные служить усилителем (энхансером) экспрессии целевого белка.

Идентификация природных последовательностей (либо синтез искусственных), которые будут усиливать биосинтез белка на уровне инициации трансляции как в прокариотических (бактерии), так и в эукариотических организмах (растения) на сравнимом уровне.

В работе применены методы центрифугирования, электрофореза нуклеиновых кислот, денатурирующего белкового электрофореза, колориметрической детекции белка, ПЦР-анализ, методы выделения нуклеиновых кислот и общего белка из бактериальных клеток, а также стандартные методики клонирования генно-инженерных кассет.

Энхансерные последовательности были исследованы на наличие транскрипционной активности в клетках E. coli. Плазмиды, несущие исследуемые 5’-НТП, были лишены последовательности промотора бактериофага Т7, и экспрессированы в клетках E. coli по стандартному протоколу. Измерение активности β-глюкуронидазы в бактериальных экстрактах показало отсутствие транскрипционной активности всех без исключения 5’-НТП. 5’-НТП Y, I, ε+SD, εII+SD, TPS__SD, TPSlongSD были клонированы в агробактериальный вектор pCambia2300 в качестве лидерных последовательностей для гена uidA, несущего в своем составе интрон 2 из гена каталазы клещевины для предотвращения прокариотической экспрессии. Ген uidA был клонирован под управление 35S промотора и nos-терминатора. Также была получена контрольная конструкция emp, которая была лишена 5’-НТП. С полученными агробактериальными плазмидами была осуществлена процедура вакуумной инфильтрации листовых пластинок табака с последующим выделением общего растворимого белка растений и измерением активности β-глюкуронидазы.

Нами было показано, что энхансеры Y, TPSlongSD и ε+SD достоверно повышают уровень экспрессии белка в 1,7 (Y и TPSlongSD) и в 2,0 раза (ε+SD) в сравнении с контролем emp.

Генетическая инженерия, биотехнология растений.

энхансеры трансляции, Еscherichia coli, Nicotiana tabacum

Идентификация природных последовательностей (либо синтез искусственных), которые будут усиливать биосинтез белка на уровне инициации трансляции как в прокариотических (бактерии), так и в эукариотических организмах (растения) на сравнимом уровне.

Зерттеу жұмысында центрифугалау әдісі, нуклеин қышқылдарының электрофорезі, белоктың флюорометрикалық анықталуы, ПТР, нуклеин қышқылдары мен ақуыздарды оқшаулау, ДНҚ кассеталарын клондау үшін генетикалық инженерия әдістері, in vitro транскрипциясы, in vitro трансляциясы, ДНҚ секвенциясы, авториадиография қолданылды.

Были сконструированы энхансеры трансляции, которые были протестированы в условиях температурного стресса как в клетках E. coli, так и в листовых дисках табака N. tabacum. Ряд энхансеров показал достоверное превышение уровня экспрессии положительного контроля SD (последовательность Шайн-Далгарно). При понижении температуры до 10ºС ни один из энхансеров не показал достоверного увеличения уровня экспрессии по сравнению с контролем в листовых дисках табака, в которых индуцировалась временная экспрессия β-глюкуронидазы посредством агроинфильтрации. В стандартных температурных условиях (23°С) достоверный уровень повышения экспрессии колебался от 1,41 до 2,35 раз для различных конструкций. В условиях теплового стресса (35°С) максимальным достоверным уровнем повышения экспрессии по сравнению с контролем был 1,67-кратный. При исследовании одного из обнаруженных энхансеров, способных усиливать экспрессию как в клетках E. coli, так и в растительной ткани, – 5’НТП гРНК PVY, была показана его способность опосредовать не-AUG инициацию трансляции в бесклеточной системе из зародышей пшеницы.

Ряд энхансеров показал достоверное превышение уровня экспрессии положительного контроля SD (последовательность Шайн-Далгарно) от 3,7 до 9,1 раза при понижении температуры культивирования клеток E. coli до 10ºС, в то же время при стандартной температуре (23°С) эти же энхансеры показали максимально 2,5-кратное повышение экспрессии по сравнению с SD. При тепловом шоке (44ºС) максимальное достоверное повышение экспрессии по сравнению с SD было 2-х кратным. Полученные в ходе реализации проекта новые универсальные энхансеры трансляции найдут применение в биотехнологии растений и микроорганизмов.

Молекулярная биология, генетическая инженерия