E.coli, кДНК гены, кодирующие AtPARP1 и AtPARP2 Arabidopsis thaliana

Выделение и функциональная экспрессия кДНК генов, кодирующих АtPARP1 и AtPARP2 Arabidopsis thaliana с гистидиновым концом (6хHIS) в клетках E.coli и очистка с помощью никель-аффинной хроматографии.

Выделение нуклеиновых кислот, Обратная транскрипция, полимеразная цепная реакция, Рестрикция фрагментов ДНК и плазмидного вектора; Элюирование гена из агарозного геля; Лигирование очищенных фрагментов и вектора; Приготовление компетентных клеток E.coli; Трансформация клеток плазмидной ДНК; Индукция экспрессии ферментов; Электрофоретическое разделение белков в ДСН-ПААГ и иммуноблотинг; Очистка рекомбинантных ферментов аффинной хроматографией; Масс-спектрометрия

Нами были выделены кДНК гены AtPARP1 и AtPARP2 с применением реакции обратной транскрипции (РОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР). Осуществлена функциональная экспрессия AtPARP1 и AtPARP2 гистидиновым концом в E. cоli и очищена никель аффинной хроматографией до гомогенного состояния. С помощью MALDI-TОF масс-спектрометрии установлена принадлежность рекомбинантных белков к семейству поли(АДФ-рибоза) -полимераз. На основе очищенного рекомбинантных белков были получены поликлональные антитела к AtPARP1 и AtPARP2. AtPARP1 и AtPARP2 в присутствии олигонуклеотидного дуплекса с разрывом и НАД+ показали авто-поли(АДФ-рибозил)ирующию активность.

нет

нет

молекулярная биология и биотехнология

Объектом исследования являются рекомбинантные белки AtPARP1 и AtPARP2 Arabidopsis thaliana.

Биохимическая характеристика АДФ-рибозилирующей активности Поли-(АДФ-рибоза)полимераз AtPARP1 и AtPARP2 A.thaliana и выявление химической природы PAR-ДНК аддуктов.

Анализ поли(АДФ-рибоза)-полимеразной активности, Сайт направленный мутагенез, Электрофоретическое разделение белков в ДСН-ПААГ, Гидролиз PAR-ДНК-полимера с помощью PARG и ДНК-модифицирующих ферментов, MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ аддуктов поли(АДФ-рибозил)ированной ДНК, Анализ эффективности AtPARP2-катализируемого ауто- и ДНК-АДФ-рибозилирования.

Показано, что наиболее предпочтительным субстратом для AtPARP1 является частичный ДНК-дуплекс (ДНК-дуплекс с 5'-выступающим участком матрицы) с 5'-фосфатной группой. В отличие от AtPARP1, AtPARP2 АДФ-рибозилирует дуплексы с брешью и/или с разрывом с 5'-фосфатной группой. AtPARP2 обладает высокой активностью АДФ-рибозилирования ДНК по сравнению с AtPARP1, но образует более короткие цепи, содержащие до 20 единиц АДФ-рибозы. Показано, что продукты АДФ-рибозилирования ДНК не образуются в отсутствие или при очень низких концентрациях НАД+ (0–10 нМ), но их образование неуклонно увеличивается при более высоких концентрациях НАД+ (от 25 nМ до 1 мМ). С использованием сайт-направленного мутагенеза получены каталитически инактивные формы ферментов АtPARP1E960K и AtPARP2E614K. Мутантные АtPARP белки не проявляли каких-либо обнаруживаемых активностей поли(АДФ-рибозил)ирования ДНК по сравнению с АtPARP белками дикого типа. Показано, что в отличие от ДНК, PARG не полностью удаляет фрагменты ADP-рибозы в белках и оставляет присоединенный моно-AДФ-рибозу к аминокислоте. АДФ-рибозилирование в ДНК обратима, что свидетельствует о том, что в условиях in vivo АtPARP2-опосредованные модификации концов разрыва цепи ДНК служат скорее временными метками по сравнению с белками. Характеристика природы высокомолекулярных продуктов, образуемых под действием AtPARP2 с помощью масс-спектрометрического MALDI-TOF анализа, подтверждает ковалентное присоединение АДФ-рибозы к ДНК.

-

нет

Природопользование и охрана окружающей среды, сельское хозяйство

Объектом исследования являются рекомбинантные белки AtPARP1 и AtPARP2 Arabidopsis thaliana.

Цель работы: Выделение и характеристика кДНК генов Поли-АДФ-рибоза полимераз Arabidopsis thaliana (PARP1, PARP2) и детальное изучение субстратной специфичности рекомбинантных ферментов. А также изучение роли Поли-АДФ-рибоза полимераз A. thaliana в ковалентной модификации разрывов цепей ДНК in vitro и in vivo.

Методы исследования: Экспрессия белков; Выделение и клонирование генов кДНК; Аффинная хроматография; Анализ активности ферментов; MALDI-TOF масс-спектрометрия; Вестерн-блоттинг; Дот блоттинг.

Результаты: Показано, что, растительные белки atPARP1 и atPARP2 как и их аналоги из млекопитающих АДФ-рибозилируют 5'-концевые фосфатные остатки в дуплексных олигонуклеотидах ДНК и плазмиде, содержащей по крайней мере два близко расположенных разрыва цепи ДНК. AtPARP1 предпочтительно катализирует ковалентное присоединение звеньев АДФ-рибозы к концам дуплексов ДНК с рецесстом, содержащих либо 3'-кордицепин, либо 5'-фосфат. Тогда как atPARP2 предпочтительно АДФ-рибозилирует дуплексы ДНК с ником и гэпом, содержащие концевой 5'-фосфат. PARP катализируемая ДНК АДФ-рибозилирование особенно чувствительно к расстоянию, которое разделяет разрывы двух цепей в одной и той же молекуле ДНК, 1,5 и 1 или 2 витка спирали для atPARP1 и atPARP2, соответственно. PAR гликогидролаза (PARG) восстанавливает нативную структуру ДНК путем гидролиза аддуктов PAR-ДНК, генерируемых atPARP. Биохимический и масс-спектрометрический анализ аддуктов PAR-ДНК показал, что atPARP используют фосфорилированные концы ДНК в качестве альтернативы белковым акцепторным остаткам для катализа синтеза цепи PAR через образование фосфодиэфирной связи между C1'АДФ-рибозы и фосфатным остатком концевого нуклеотида в фрагменте ДНК. Взятые вместе, эти данные устанавливают присутствие нового типа ДНК-модифицирующей активности в PARP арабидопсиса, предполагая возможную роль АДФ-рибозилирования ДНК в передаче сигналов повреждения ДНК и восстановлении наземных растений.

нет

Молекулярная биология и биотехнология