гены вируса оспы овец sppv117 и sppv060, кодируемые ими белки, растения табака Nicotiana tabacum и бактерии E. coli штамма DH5α

разработать технологию получения рекомбинантных антигенов вируса оспы овец на базе растений табака Nicotiana tabacum с хлоропластной экспрессией гена sppv117, кодирующего антигенный белок SPPV-А27L

компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, молекулярное клонирование нуклеиновых кислот, ПЦР, рестрикционный анализ, секвенирование ДНК, электрофорез нуклеиновых кислот, спектрофотометрия, биобаллистический метод трансформации растений, методы растительных культур in vitr

Гены sppv117 и sppv060 были клонированы в вектора pHK20 и pKG27 под контроль хлоропластных промоторов PrrnL, PpsbA и терминаторов транскрипции TrbcL, TpsbA. Нуклеотидные последовательности генов sppv117 и sppv060 в составе ДНК-конструкций [PrrnL-sppv117-TrbcL], [PrrnL-sppv60-TrbcL], [PpsbA-sppv117-TpsbA] и [PpsbA-sppv60-TpsbA] были выверены секвенированием. Полученные кассеты были переклонированы в вектор pNT4, обеспечивающий интеграцию целевого гена в межгенный район trnG/trnfM хлоропластного генома. Для проведения трансформации растений были выделены в препаративных количествах плазмидные ДНК созданных хлоропластных векторов pNT4/PrrnL-sppv117-TrbcL, pNT4/PrrnL-sppv60-TrbcL, pNT4/PpsbA-sppv117-TpsbA и pNT4/PpsbA-sppv60-TpsbA. Методом бомбардировки листьев микрочастицами золота была проведена трансформация растений табака N. tabacum полученными ДНК-конструкциями. Получены растения-регенеранты.

опубликовано 3 работы, в т.ч. подана 1 заявка на патент РК

биотехнология растений, ветеринария

гены вируса оспы овец sppv117 и sppv060, кодируемые ими белки, растения табака Nicotiana tabacum

разработать технологию получения рекомбинантных антигенов вируса оспы овец на базе растений табака Nicotiana tabacum с хлоропластной экспрессией гена sppv117, кодирующего антигенный белок SPPV-А27L.

компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, методы растительных культур in vitro, ПЦР, рестрикционный анализ, электрофорез нуклеиновых кислот и белков, спектрофотометрия, Вестерн-блоттинг, Саузерн-блоттинг.

Проведено тестирование методом ПЦР на наличие трансгенов в растениях-регенерантах, полученных в опытах по трансформации хлоропластов растений табака N. tabacum ДНК-конструкциями pNT4-A27L и pNT4-L1R, содержащими гены вируса оспы овец sppv117 и sppv060 под контролем хлоропластных промоторов транскрипции Prrn или PpsbA, терминаторов транскрипции TrbcL или TpsbA. Показано, что cемь отобранных линий несут целевой ген вируса оспы овец sppv117, кодирующий антигенный белок SPPV-А27L, три линии содержат ген sppv060, кодирующий белок SPPV-L1R.

По результатам данного проекта опубликовано 4 работы

биотехнология растений, ветеринария.

Гены вируса оспы овец sppv117 и sppv060, кодируемые ими белки, растения табака Nicotiana tabacum

Разработка технологии получения рекомбинантного антигена вируса оспы овец на базе растений табака N. tabacum с хлоропластной экспрессией гена sppv117, кодирующего антигенный белок SPPV-А27L

Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, клонирование, рестрикционный анализ, электрофорез нуклеиновых кислот и белков, бомбардмент, методы растительных культур in vitro, ПЦР, спектрофотометрия, Вестерн-блоттинг, Саузерн-блоттинг, Нозерн блоттинг

Для проведения генетической трансформации хлоропластов созданы четыре конструкции, обеспечивающие интеграцию полноразмерного гена sppv117 и делеционного варианта гена sppv060 (sppv060Δ), кодирующих соответственно белок SPPV-A27L и эктодомен белка SPPV-L1 в хлоропластный геном табака в межгенную область trnG/trnfM. Методом биобаллистики с помощью «генной пушки» получили линии табака, устойчивые к селективному антибиотику спектиномицину. ПЦР-анализом в присутствии генспецифичных праймеров подтвердили интеграцию целевой вставки в растительный геном. Последующие Нозерн-блот и Вестерн-блот анализы препаратов РНК и белковых экстрактов из полученных растений показали экспрессию целевого гена на транскрипционном и трансляционном уровне. Содержание рекомбинантных белков составляло от 0,30% до 0,99% от общего растворимого белка. Проведена проверка генетической однородности пластидных геномов девяти линий табака методом Саузерн-блоттинга, показавшая гомопластидность трех линий и гетеропластидность остальных шести. Методом металлоафинной хроматографии проведена очистка рекомбинантных белков из растительной ткани. Собраны семена транспластомных растений.

По результатам данного проекта опубликовано 7 работ

биотехнология растений, ветеринария

гены вируса оспы овец sppv117 и sppv060, кодируемые ими белки, растения табака Nicotiana tabacum

разработка технологии получения рекомбинантного антигена вируса оспы овец на базе растений табака N. tabacum с хлоропластной экспрессией гена sppv117, кодирующего антигенный белок SPPV-А27L

компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, клонирование, рестрикционный анализ, электрофорез нуклеиновых кислот и белков, бомбардмент, методы растительных культур in vitro, ПЦР, спектрофотометрия, Вестерн-блоттинг, Саузерн-блоттинг, Нозерн блоттинг

Для проведения генетической трансформации хлоропластов созданы четыре конструкции, обеспечивающие интеграцию полноразмерного гена sppv117 и делеционного варианта гена sppv060 (sppv060Δ), кодирующих соответственно белок SPPV-A27L и эктодомен белка SPPV-L1 в хлоропластный геном табака в межгенную область trnG/trnfM. Методом биобаллистики с помощью «генной пушки» получили линии табака, устойчивые к селективному антибиотику спектиномицину. ПЦР-анализом в присутствии генспецифичных праймеров подтвердили интеграцию целевой вставки в растительный геном. Последующие Нозерн-блот и Вестерн-блот анализы препаратов РНК и белковых экстрактов из полученных растений показали экспрессию целевого гена на транскрипционном и трансляционном уровне. Содержание рекомбинантных белков составляло от 0,30% до 0,99% от общего растворимого белка. Проведена проверка генетической однородности пластидных геномов девяти линий табака методом Саузерн-блоттинга, показавшая гомопластидность трех линий и гетеропластидность остальных шести. Методом металлоафинной хроматографии проведена очистка рекомбинантных белков из растительной ткани. Собраны семена транспластомных растений.

Хлоропласты показали себя в качестве подходящей экспрессионной системой для синтеза антигенных белков SPPV-А27L и SPPV-L1RΔ, выбранных нами в качестве субъединичных кандидатных вакцин против оспы овец; пластидный промотор Prrn по сравнению с промотором PpsbA обеспечивал более высокий выход вирусных белков;формат векторов pR117и pR060Δ приводит к реорганизации хлоропластной ДНК и изменению окраски листьев транспластомных растений.

биотехнология растений, ветеринария