Зерновки, проростки и растения пшеницы (Triticum aestivum L.).

Определить изоферментный состав и биохимические свойства хитин- и β-глюкан-связывающих ферментов пшеницы в норме.

Колоночная хроматография, электрофорез, изоэлектрофокусирование, спектрофотометрия, центрифугирование.

ХС хитиназа и ГС β-1,3-глюканаза пшеницы представлена 3-5 белками с близкими молекулярными массами около 30 кД и состоял из изоферментов с ИЭТ 9.0, 5.6, 4.3. β-1,3-Глюканаза включала изоформы с ИЭТ 5.0, 7.0, 7.8, 8.6 и 9.3. Ферменты активны в диапазоне рН - от 3,5 до 9,5 с оптимумом 5-5,5. Температурный оптимум для хитиназы и глюканазы - 30 и 40оС соответственно. Катионы Cu2+ ингибировали, а катионы Mn2+ стимулировали активность ферментов, особенно хитиназы. Листовая β-1,3-глюканаза представлена широким набором изоферментов с ИЭТ в щелочной области от 9.0 до 9.5, 7.0-8.0, в кислой - 5.0-6.0 и мажорным компонентом с ИЭТ вблизи рН 4.0. Спектр хитиназ, специфичных к хитину также гетерогенен. Общими для всех органов являлись щелочные изоформы с ИЭТ 9.0, 8.7, 8.2 и кислые - с ИЭТ 5.6, 4.3, 4.0. В целом, содержание защитных ферментов β-1,3-глюканазы и хитиназы в вегетирующих органах (корни, стебли и листья) выше по сравнению с запасающими органами (зерновки) пшеницы.

Электрофоретическая идентификация и биохимическая характеристика хитин-связывающих хитиназ и β-глюкан-связывающих глюканаз и их изоформ, как потенциальных белковых маркеров для тестирования сортов пшеницы на устойчивость к фитопатогенным грибам рода Fusarium.

Сельское хозяйство, селекция зерновых культур.

зерновки, стебли и корни проростков пшеницы (Triticum aestivum L., сорт Казахстанская 10), фитопатогенный гриб F. graminearum

определить влияние культурального фильтрата гриба F. graminearum и углеводных элиситоров на активность и изоферментный состав хитин- и β-глюкан-связывающих ферментов пшеницы.

культивирование гриба F. graminearum, спектрофотометрия, изоэлектрофокусирование, центрифугирование

Оптимизирован метод получения культурального фильтрата F. graminearum, дана его биохимическая характеристика. При 96 ч воздействии КФ на 3-х суточные проростки максимум активизации β-1,3-глюканазы и хитиназы отмечен в конце проращивания – на 72 и 96 ч. В ростках КФ усиливал активность изоферментов кислой (рI 3.0-5.6) и щелочной области (рI 8.8-9.2), а в корнях в дополнение к ним - нейтральных компонентов с рI 7.2-7.4. Фермент-индуцирующий эффект 6-недельного КФ на 7-суточные проростки чаще проявлялся к 9 ч, а для 4-недельного КФ – на 18 и 24 ч. В целом, наибольшим стимулирующим эффектом на активность β-1,3-глюканазы и хитиназы обладал КФ 6-недельной культуры гриба, а наименьшим – 2-недельный КФ. Для 4 и 6-недельного КФ характерно выраженное 2-х фазное (по времени) индуцирующее воздействие на ферменты. Выявлены особенности действия углеводных элиситоров – хитозанолигосахарида (ХОС), ламинарина и полигалактуроновой кислоты (ПГК) на активность β-1,3-глюканазы и хитиназы проростков пшеницы. В ростках индукция ферментов происходила в начале (3-6 ч), а в корнях – в конце на 18 ч экспозиции. Наибольшим активирующим эффектом на β-1,3-глюканазу и хитиназу обладал ХОС, который в малой дозе (0,01 мг/мл) сильно индуцировал в проростках оба фермента уже в начальный период – к 3 и 6 ч. Ламинарин отличался продолжительным действием с 2-3 пиками активности β-1,3-глюканазы и хитиназы. Наименьшие элиситорные свойства проявляла ПГК, вызывавшая подъем ферментов в первые 6 ч воздействия.

Оптимизация метода получения культурального фильтрата F. graminearum, биохимическая характеристика и анализ действие на активность β-1,3-глюканазы и хитиназы проростков пшеницы. Эффект углеводных элиситоров хитозанолигосахарида, ламинарина и полигалактуроновой кислоты на активность β-1,3-глюканазы и хитиназы проростков пшеницы.

сельское хозяйство, селекция зерновых культур

Зерна, корни, стебли проростков пшеницы (Triticum aestivum L.), гриб F. graminearum.

Выявление и характеристика хитин и β-глюкан-связывающих ферментов для применения в тестировании устойчивости сортов пшеницы к фузариозу

Аффинная хроматография, изоэлектрофокусирование (ИЭФ), SDS-ПАГ электрофорез, спектрофотометрия, культивирование гриба.

Получены очищенные хитин связывающая хитиназа (ХС) и β-глюкан связывающая (ГС) β-1,3-глюканаза проростков пшеницы, определены их физико-химические свойства. Изоферменты ХС хитиназы имели широкий спектр pI от 4,.3 до 9.0, М.в. соответствовал 28, 33 и 35 кДа. ГС β-1,3-глюканаза включала изоформы с pI от 5.0 до 9.3. Оптимум рН обоих ферментов 5.0-5.5, температурный оптимум-от 30 до 40оС. Оба фермента сохраняли активность после прогрева 60оС 10 мин. Удельная активность ферментов и их гетерогенность при ИЭФ в корнях, стеблях и листьях была выше, чем в зерне. Наибольший активирующий эффект на β-1,3-глюканазу и хитиназу проростков пшеницы оказывал культуральный фильтрат (КФ) 6-недельной культуры гриба, а наименьший – 2-недельный КФ. Для 4 и 6-недельного КФ был характерен 2-х фазный временной фермент-активирующий эффект. Хитозанолигосахарид в малой дозе (0,01 мг/мл) сильно индуцировал в проростках β-1,3-глюканазу и хитиназу. Ламинарин оказывал наиболее продолжительный эффект с 2-3 пиками активности ферментов. В проростках 26 сортов пшеницы выявлена существенная вариабельность в уровне активности и изоферментном составе β-1,3-глюканазы и хитиназы в норме. Для 8 отобранных сортов установлены особенности поведения ферментов в ответ на заражение F. graminearum. На изоферментном уровне у всех сортов строго прослеживалась активация щелочного компонента ГС β-1,3-глюканазы с pI 9.0 и индукция или усиление кислых изоферментов с ХС хитиназы с pI 4.6 и 5.1.

В проведенном исследовании получены новые данные по биохимическим свойствам β-1,3-глюканазы и хитиназы у важной зерновой культуры пшеницы, идентификации и ответных защитных реакциях отдельных изоформ на заражение широко распространенным патогеном F. graminearum. Эти белки могут быть использованы в качестве биохимических маркеров для тестирования сортов пшеницы на устойчивость к грибным патогенам.

Биотехнология, селекция зерновых культур.